使用 VALO 540nm 綠色飛秒激光進行色氨酸的雙光子 FLIM 研究 色氨酸是一種必需氨基酸，它與其他氨基酸一起，是大多數蛋白質的組成部分。色氨酸具有熒光性，其熒光是蛋白質熒光的主要部分。色氨酸熒光取決于生物學參數，如蛋白質組成、蛋白質折疊以及較近分子環境中其他氨基酸的存在情況。這種依賴性使色氨酸成為生物系統中分子參數的潛在熒光標記物。特別是當通過熒光壽命成像（FLIM）檢測色氨酸熒光時，情況更是如此。問題在于，色氨酸的激發波長處于深紫外區域，普通顯微鏡無法達到。在本文中，我們展示了如何通過時間相關單光子計數熒光壽命成像（TCSPC FLIM）結合新型綠色飛秒激光的雙光子激發來獲取色氨酸壽命圖像。 圖1：顯示色氨酸熒光的酵母細胞的熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）圖像。在540納米處進行雙光子激發，在320至380納米范圍內進行檢測。 色氨酸熒光 色氨酸（TRP）熒光成像的問題在于其激發光和發射光的波長都處于紫外波段。最大激發波長約為280納米，發射光波段范圍約為300納米至400納米。色氨酸的吸收光譜和發射光譜如圖2所示。 圖2：色氨酸的吸收光譜（左）和發射光譜（右）（數據來自[9]）通過傳統熒光技術，色氨酸熒光只能在傳統熒光光譜儀或配備特殊紫外物鏡的類似裝置中記錄。通過這種方式，可以獲得熒光衰減曲線。在普通顯微鏡中，無法直接激發色氨酸，因為所需的激發波長無法通過顯微鏡光學系統。在激光掃描顯微鏡中，這個問題更為嚴重，因為激發光還必須通過掃描器光學系統。一種有望避免紫外問題的方法是使用多光子激發。研究表明，三光子（3 - p）激發可以獲得有用的結果。對于3 - p激發，使用的波長范圍是750納米至840納米。合適的波長可以很容易地從鈦寶石激光器中獲得。喬恩蒂庫馬爾等人發表了3p激發色氨酸成像的早期研究結果。作者使用了配備abh SPC - 152熒光壽命成像（FLIM）系統的蔡司LSM 780。他們發現，當用葡萄糖處理細胞時，結合態NADH濃度增加會導致色氨酸（TRP）壽命縮短。阿拉姆等人使用類似系統記錄前列腺癌（PCa）細胞中NAD（P）H、FAD和TRP熒光的壽命圖像，并量化細胞對阿霉素治療的代謝反應。 不幸的是，色氨酸的3p激發存在一個潛在問題。3p激發需要高激光功率，在焦平面上通常超過10毫瓦。這對于色氨酸溶液來說不成問題，但在細胞中卻是個問題。細胞中含有NADH和FAD。在740納米至840納米波長范圍內，激光以雙光子激發的全部功率擊中這些輔酶的吸收帶，見圖3。在740納米波長處使用7毫瓦至8毫瓦的功率。這明顯高于通常用于NADH和FAD成像的功率，幾乎肯定會對細胞造成損傷。從細胞的色氨酸發射帶獲得的計數率約為每秒不到10000個計數。 另一種可能性是通過雙光子（2p）激發來激發色氨酸。色氨酸的最佳激發波長將在530至560納米范圍內。如圖3所示，NADH或FAD在該波長下沒有明顯吸收。因此，可以預期光損傷將保持在可接受的水平。直到最近，問題在于沒有合適的具有所需波長的飛秒激光器。現在，已經推出了波長為540納米的飛秒激光器。這促使我們嘗試使用2p激發對色氨酸進行雙光子熒光壽命成像（FLIM）。 圖3：多光子激發對瞬時受體電位通道（TRP）的激發。紅色：825納米激光。綠色：825納米激光。可以看出，825納米的三光子激發也會激發黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。540納米的雙光子激發則不存在這個問題。 雙光子色氨酸熒光壽命成像系統 我們的色氨酸系統基于標準的Becker & Hickl DCS-120 MP多光子熒光壽命成像系統。其原理如圖4所示。光學部分由一個bh DCS - 120掃描頭、一臺尼康Ti 2E顯微鏡、一臺帶有二次諧波產生（SHG）選項的560 nm VALO Aalto激光器[11]以及兩個HPM - 100混合探測器組成。其原理如圖4所示。該激光器在540 nm波長處提供50 mW的光功率。激光束通過一個快門和一個可變衰減器。掃描由DCS - 120 MP掃描頭完成。掃描頭的掃描透鏡將激光束沿著顯微鏡光路向下投射到顯微鏡物鏡上。為了在激發和檢測方面都獲得高效率，我們使用了一個放大倍數為40倍、數值孔徑NA = 1.3的油浸物鏡。熒光通過顯微鏡物鏡收集回來，通過顯微鏡濾光輪中的520 nm二向色分束器與激發光分離，并通過顯微鏡的后端口輸出。光通過常規的NDD（非掃描檢測）光路傳輸到探測器。散射的激光通過一個500 nm短通濾光片去除。DCS系統有兩個探測器。對于色氨酸記錄，我們僅使用其中一個。檢測到的信號進一步通過一個360/40帶通濾光片進行凈化。該信號通過DCS - 120系統的兩個SPC - 180NX熒光壽命成像（FLIM）模塊[3]之一，由bh的多維時間相關單光子計數（TCSPC）FLIM程序[2, 3, 5]進行記錄。更多細節請參見[3, 4]。 實驗結果 圖5展示了活酵母細胞的色氨酸壽命圖像。樣品平面內的激發功率為2毫瓦，采集時間為60秒。在該時間內，以每秒90×103個光子的計數率采集到550萬個光子。光子數量足以進行雙指數衰減分析。光標位置的衰減成分分別為49%的632皮秒和51%的3525皮秒。幅度加權壽命為2108皮秒。 圖5：酵母細胞的色氨酸熒光壽命成像。左圖：壽命圖像。雙指數衰減的幅度加權壽命。右圖：光標位置的衰減函數。圖像格式為512×512像素，1024個時間通道，540納米雙光子激發，壽命范圍為1000皮秒至4000皮秒。使用bh SPCImage NG9.0軟件進行分析[6]。圖6展示了活的大腸桿菌（E. coli）的色氨酸壽命圖像。大腸桿菌并非易成像的目標。它們體積小且移動迅速。所示圖像的采集時間為90秒。整幅圖像包含約1000萬個光子。該圖像采用雙指數衰減模型進行分析。光標位置處的衰減成分分別為1573皮秒的62.7%和4740皮秒的37.3%。幅度加權壽命為2762皮秒。 圖6：大腸桿菌的色氨酸熒光壽命成像。左圖：壽命圖像。雙指數衰減的幅度加權壽命。右圖：光標位置的衰減函數。512×512像素，1024個時間通道，540納米雙光子激發，壽命范圍從1000皮秒到4000皮秒。使用bh SPCImageNG 9.0進行分析[6]。 為作比較，圖7展示了色氨酸在水溶液中的衰減曲線。這些數據是使用與上述熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）數據相同的系統采集得到的，該曲線是通過將所有像素的數據合并到一條衰減曲線中創建出來的[6]。 圖7：色氨酸在水中的衰減曲線。與熒光壽命成像（FLIM）圖像使用同一系統記錄。采集時間160秒，由bh SPCImage NG9.0分析。 該衰變由64.8%的2463皮秒成分和35.2%的3192皮秒成分組成，接近單指數形式。幅度加權壽命為2719皮秒。這些數值與從酵母細胞和大腸桿菌細胞中獲得的壽命相符。這有力地表明，細胞的發射光確實來自色氨酸。細胞中的衰變函數更接近雙指數（a1比溶液中更高，t1比溶液中更低），這一事實可以用色氨酸環境的不均勻性以及可能存在的從色氨酸到煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的熒光共振能量轉移（FRET）來解釋。在前列腺癌細胞中已發現FRET現象，并且在酵母細胞和大腸桿菌細胞中似乎也有可能發生。嘗試計算酵母細胞中假設的FRET效率，得到圖8所示的FRET圖像。左側顯示經典FRET效率的彩色編碼圖像，右側顯示光標位置處FRET效率和衰變參數的分布。最常見的FRET效率為0.46，這對于色氨酸 - 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的FRET來說是一個合理的值。 圖8：假設的TRP-NADH能量轉移的熒光共振能量轉移（FRET）圖像。左圖：顯示顏色編碼（傳統）FRET效率的圖像。右圖：像素上FRET效率的分布以及光標位置的衰減參數。由bh SPCImage NG 9.0進行分析。 Summary 總結 我們展示了一種熒光壽命成像（FLIM）系統，該系統能夠記錄活細胞中色氨酸（TRP）的壽命圖像。該系統基于標準的bh DCS - 120 MP多光子FLIM系統[4]。與已知的三光子方法不同，該系統采用新型540納米飛秒激光器進行雙光子激發[11]。通過這種方式，可避免因煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的不必要激發而造成的光損傷。我們通過記錄大腸桿菌細胞和酵母細胞的TRP圖像，展示了該系統的應用。樣品平面的激發功率約為3毫瓦，TRP發射波段的計數率約為每秒90,000至100,000個光子。衰減函數為雙指數形式，酵母細胞的成分分別為632皮秒和3525皮秒，大腸桿菌細胞的成分分別為1573皮秒和4740皮秒。溶液中TRP的壽命成分分別為2463皮秒和3192皮秒。 References 如果您對于上面描述的BH的FLIM系統或者 540nm ?Valo 飛秒激光感興趣可以聯系大偵探咨詢！ dynadmin|2025-11-07T13:16:03+08:002025年11月4日|產品資訊, 新聞中心|
